人(Ren)水(Shui)通(Tong)道(Dao)蛋(Dan)白(Bai)-2elisa检(Jian)测(Ce)试(Shi)剂(Ji)盒(He)反(Fan)应(Ying)流(Liu)程(Cheng)常(Chang)规(Gui)程(Cheng)序(Xu):

将(Jiang)PCR反(Fan)应(Ying)所(Suo)需(Xu)的(De)成(Cheng)分(Fen)配(Pei)置(Zhi)完(Wan)后(Hou)，(?)在(Zai)PCR仪(Yi)上(Shang)于(Yu)94-96℃(?)预(Yu)加(Jia)热(Re)几(Ji)十(Shi)秒(Miao)至(Zhi)几(Ji)分(Fen)钟(Zhong)，(?)使(Shi)模(Mo)板(Ban)DNA充(Chong)分(Fen)变(Bian)性(Xing)，(?)然(Ran)后(Hou)进(Jin)入(Ru)扩(Kuo)增(Zeng)循(Xun)环(Huan)。(?)在(Zai)每(Mei)一(Yi)个(Ge)循(Xun)环(Huan)中(Zhong)，(?)先(Xian)于(Yu)94℃(?)保(Bao)持(Chi)30秒(Miao)钟(Zhong)使(Shi)模(Mo)板(Ban)变(Bian)性(Xing)，(?)然(Ran)后(Hou)将(Jiang)温(Wen)度(Du)降(Jiang)到(Dao)复(Fu)性(Xing)温(Wen)度(Du)（(?)一(Yi)般(Ban)50-60℃(?)之(Zhi)间(Jian)）(?)，(?)一(Yi)般(Ban)保(Bao)持(Chi)30秒(Miao)钟(Zhong)，(?)使(Shi)引(Yin)物(Wu)与(Yu)模(Mo)板(Ban)充(Chong)分(Fen)退(Tui)火(Huo)；(?)在(Zai)72℃(?)保(Bao)持(Chi)1分(Fen)钟(Zhong)（(?)扩(Kuo)增(Zeng)1kb片(Pian)段(Duan)）(?)，(?)使(Shi)引(Yin)物(Wu)在(Zai)模(Mo)板(Ban)上(Shang)延(Yan)伸(Shen)，(?)合(He)成(Cheng)DNA，(?)完(Wan)成(Cheng)一(Yi)个(Ge)循(Xun)环(Huan)。(?)重(Zhong)复(Fu)这(Zhe)样(Yang)的(De)循(Xun)环(Huan)25～(?)35次(Ci)，(?)使(Shi)扩(Kuo)增(Zeng)的(De)DNA片(Pian)段(Duan)大(Da)量(Liang)累(Lei)积(Ji)。(?)最(Zui)后(Hou)，(?)在(Zai)72℃(?)保(Bao)持(Chi)3-7min，(?)使(Shi)产(Chan)物(Wu)延(Yan)伸(Shen)完(Wan)整(Zheng)，(?)4℃(?)保(Bao)存(Cun)。(?)

2．(?)复(Fu)性(Xing)（(?)退(Tui)火(Huo)）(?)和(He)延(Yan)伸(Shen)温(Wen)度(Du)

复(Fu)性(Xing)的(De)温(Wen)度(Du)是(Shi)PCR扩(Kuo)增(Zeng)是(Shi)否(Fou)顺(Shun)利(Li)的(De)关(Guan)键(Jian)因(Yin)素(Su)，(?)通(Tong)常(Chang)在(Zai)50-60℃(?)之(Zhi)间(Jian)。(?)具(Ju)体(Ti)的(De)温(Wen)度(Du)主(Zhu)要(Yao)由(You)引(Yin)物(Wu)的(De)Tm值(Zhi)决(Jue)定(Ding)。(?)延(Yan)伸(Shen)温(Wen)度(Du)绝(Jue)大(Da)多(Duo)数(Shu)设(She)定(Ding)为(Wei)72℃(?)。(?)如(Ru)果(Guo)复(Fu)性(Xing)的(De)温(Wen)度(Du)很(Hen)高(Gao)，(?)可(Ke)以(Yi)将(Jiang)延(Yan)伸(Shen)温(Wen)度(Du)和(He)复(Fu)性(Xing)温(Wen)度(Du)设(She)置(Zhi)成(Cheng)同(Tong)一(Yi)温(Wen)度(Du)，(?)变(Bian)成(Cheng)二(?)步(Bu)法(Fa)PCR。(?)

3．(?)反(Fan)应(Ying)时(Shi)间(Jian)

变(Bian)性(Xing)步(Bu)骤(Zhou)一(Yi)般(Ban)使(Shi)用(Yong)30秒(Miao)钟(Zhong)，(?)如(Ru)果(Guo)模(Mo)板(Ban)的(De)G+C含(Han)量(Liang)较(Jiao)高(Gao)，(?)或(Huo)直(Zhi)接(Jie)用(Yong)细(Xi)胞(Bao)做(Zuo)模(Mo)板(Ban)，(?)变(Bian)性(Xing)时(Shi)间(Jian)可(Ke)适(Shi)当(Dang)延(Yan)长(Chang)。(?)复(Fu)性(Xing)时(Shi)间(Jian)有(You)30秒(Miao)种(Zhong)一(Yi)般(Ban)是(Shi)足(Zu)够(Gou)的(De)。(?)延(Yan)伸(Shen)时(Shi)间(Jian)由(You)扩(Kuo)增(Zeng)产(Chan)物(Wu)的(De)大(Da)小(Xiao)决(Jue)定(Ding)，(?)一(Yi)般(Ban)采(Cai)用(Yong)1kb用(Yong)1分(Fen)钟(Zhong)来(Lai)保(Bao)证(Zheng)充(Chong)足(Zu)的(De)时(Shi)间(Jian)。(?)

4．(?)循(Xun)环(Huan)次(Ci)数(Shu)

循(Xun)环(Huan)次(Ci)数(Shu)主(Zhu)要(Yao)与(Yu)模(Mo)板(Ban)的(De)起(Qi)始(Shi)数(Shu)量(Liang)有(You)关(Guan)，(?)在(Zai)模(Mo)板(Ban)拷(Kao)贝(Bei)数(Shu)为(Wei)104～(?)105数(Shu)量(Liang)级(Ji)时(Shi)，(?)循(Xun)环(Huan)数(Shu)通(Tong)常(Chang)为(Wei)25～(?)35次(Ci)。(?)

平(Ping)台(Tai)效(Xiao)应(Ying)（(?)plateaueffect）(?)：(?)PCR扩(Kuo)增(Zeng)过(Guo)程(Cheng)后(Hou)期(Qi)会(Hui)出(Chu)现(Xian)的(De)产(Chan)物(Wu)的(De)积(Ji)累(Lei)按(An)减(Jian)弱(Ruo)的(De)指(Zhi)数(Shu)速(Su)率(Lu)增(Zeng)长(Chang)的(De)现(Xian)象(Xiang)。(?)原(Yuan)因(Yin)：(?)底(Di)物(Wu)和(He)引(Yin)物(Wu)的(De)浓(Nong)度(Du)已(Yi)经(Jing)降(Jiang)低(Di)，(?)dNTP和(He)DNA聚(Ju)合(He)酶(Mei)的(De)稳(Wen)定(Ding)性(Xing)或(Huo)活(Huo)性(Xing)降(Jiang)低(Di)，(?)产(Chan)生(Sheng)的(De)焦(Jiao)磷(Lin)酸(Suan)会(Hui)出(Chu)现(Xian)末(Mo)端(Duan)产(Chan)物(Wu)抑(Yi)制(Zhi)作(Zuo)用(Yong)，(?)非(Fei)特(Te)异(Yi)性(Xing)产(Chan)物(Wu)或(Huo)引(Yin)物(Wu)的(De)二(?)聚(Ju)体(Ti)出(Chu)现(Xian)非(Fei)特(Te)异(Yi)性(Xing)竞(Jing)争(Zheng)作(Zuo)用(Yong)，(?)扩(Kuo)增(Zeng)产(Chan)物(Wu)自(Zi)身(Shen)复(Fu)性(Xing)，(?)高(Gao)浓(Nong)度(Du)扩(Kuo)增(Zeng)产(Chan)物(Wu)变(Bian)性(Xing)不(Bu)*。(?)

5．(?)PCR反(Fan)应(Ying)液(Ye)的(De)配(Pei)制(Zhi)

PCR反(Fan)应(Ying)体(Ti)系(Xi)的(De)配(Pei)置(Zhi)方(Fang)式(Shi)有(You)时(Shi)也(Ye)会(Hui)影(Ying)响(Xiang)反(Fan)应(Ying)的(De)正(Zheng)常(Chang)进(Jin)行(Xing)。(?)常(Chang)规(Gui)方(Fang)法(Fa)与(Yu)其(Qi)它(Ta)酶(Mei)学(Xue)反(Fan)应(Ying)一(Yi)样(Yang)，(?)在(Zai)最(Zui)后(Hou)加(Jia)入(Ru)DNA聚(Ju)合(He)酶(Mei)。(?)早(Zao)期(Qi)的(De)PCR仪(Yi)没(Mei)有(You)带(Dai)加(Jia)热(Re)的(De)盖(Gai)子(Zi)，(?)要(Yao)求(Qiu)在(Zai)反(Fan)应(Ying)液(Ye)上(Shang)覆(Fu)盖(Gai)一(Yi)层(Ceng)矿(Kuang)物(Wu)油(You)，(?)防(Fang)止(Zhi)水(Shui)分(Fen)蒸(Zheng)发(Fa)。(?)

对(Dui)于(Yu)使(Shi)用(Yong)具(Ju)3’(?)-5’(?)外(Wai)切(Qie)活(Huo)性(Xing)的(De)高(Gao)温(Wen)DNA聚(Ju)合(He)酶(Mei)时(Shi)，(?)有(You)时(Shi)会(Hui)扩(Kuo)增(Zeng)不(Bu)出(Chu)产(Chan)物(Wu)。(?)在(Zai)遇(Yu)到(Dao)这(Zhe)个(Ge)问(Wen)题(Ti)时(Shi)，(?)如(Ru)果(Guo)将(Jiang)反(Fan)应(Ying)成(Cheng)分(Fen)分(Fen)开(Kai)配(Pei)制(Zhi)，(?)A管(Guan)含(Han)模(Mo)板(Ban)、(?)引(Yin)物(Wu)和(He)dNTP，(?)以(Yi)及(Ji)调(Diao)整(Zheng)体(Ti)积(Ji)的(De)H2O，(?)B管(Guan)含(Han)缓(Huan)冲(Chong)液(Ye)、(?)DNA聚(Ju)合(He)酶(Mei)和(He)水(Shui)，(?)然(Ran)后(Hou)再(Zai)将(Jiang)两(Liang)管(Guan)溶(Rong)液(Ye)混(Hun)合(He)起(Qi)来(Lai)，(?)可(Ke)较(Jiao)好(Hao)地(Di)克(Ke)服(Fu)这(Zhe)个(Ge)问(Wen)题(Ti)。(?)

按(An)照(Zhao)常(Chang)规(Gui)的(De)方(Fang)法(Fa)配(Pei)制(Zhi)反(Fan)应(Ying)体(Ti)系(Xi)，(?)有(You)时(Shi)会(Hui)出(Chu)现(Xian)非(Fei)特(Te)异(Yi)性(Xing)扩(Kuo)增(Zeng)的(De)问(Wen)题(Ti)。(?)热(Re)启(Qi)动(Dong)（(?)hotstart）(?)PCR操(Cao)作(Zuo)方(Fang)式(Shi)可(Ke)较(Jiao)好(Hao)解(Jie)决(Jue)这(Zhe)一(Yi)问(Wen)题(Ti)。(?)将(Jiang)dNTP、(?)缓(Huan)冲(Chong)液(Ye)，(?)Mg2+和(He)primer先(Xian)配(Pei)制(Zhi)好(Hao)，(?)然(Ran)后(Hou)加(Jia)入(Ru)一(Yi)粒(Li)蜡(La)珠(Zhu)（(?)如(Ru)AmpliWaxPCRQam100）(?)，(?)加(Jia)热(Re)熔(Rong)化(Hua)，(?)再(Zai)冷(Leng)却(Que)，(?)使(Shi)蜡(La)将(Jiang)溶(Rong)液(Ye)封(Feng)住(Zhu)，(?)最(Zui)后(Hou)加(Jia)入(Ru)模(Mo)板(Ban)和(He)DNA聚(Ju)合(He)酶(Mei)等(Deng)剩(Sheng)余(Yu)成(Cheng)分(Fen)。(?)只(Zhi)有(You)当(Dang)PCR反(Fan)应(Ying)进(Jin)入(Ru)高(Gao)温(Wen)阶(Jie)段(Duan)后(Hou)，(?)蜡(La)层(Ceng)熔(Rong)化(Hua)，(?)所(Suo)有(You)反(Fan)应(Ying)成(Cheng)分(Fen)才(Cai)会(Hui)混(Hun)合(He)在(Zai)一(Yi)起(Qi)。(?)